Aktuella Forskningsprojekt

 

1. Utveckling av läkemedelsresistens genom enzymevolution

 
Resistens mot läkemedel är ett stort och växande problem inom sjukvården. Resistens som uppkommer vid behandling av patienter kan göra läkemedel verkningslösa. Vissa sjukdomar kan redan initialt vara svårbehandlade på grund av en ursprunglig läkemedelsresistens, medan behandling av andra ger upphov till resistens genom en kombination av mutationsframkallande processer och urval av mutanter av celler eller molekyler som bär resistensegenskaperna. I detta forskningsprojekt studeras resistens som orsakas av att läkemedel bryts ned av enzymer. 
 
Detta är fallet vid behandling av infektionssjukdomar med antibiotika, men också vid kemoterapi av tumörsjukdomar. Vi studerar ett enzym som ursprungligen saknar förmågan att bryta ned aktuella läkemedel, men som genom strukturella förändringar förvärvar denna aktivitet. Vi kommer nu att undersöka hur genen för det inaktiva proteinet kan muteras och ge upphov till resistens hos bakterier. Ett rekombinantenzym från människa med viss strukturell likhet till bakteriella beta-laktamaser som bryter ned penicillin och liknande läkemedelsmolekyler muteras med biokemisk metodik så att nya enzymer förändrade egenskaper bildas. Enzymvarianterna testas i salmonellabakterier som odlas i närvaro av olika beta-laktamantibiotika.

 

Utveckling av läkemedelsresistens genom enzymevolution

 
Bakterier som växer i närvaro av höga koncentrationer av antibiotika isoleras och sambandet med ökad enzymaktivitet valideras. Liknande försök har tidigare utförts av andra forskare. Det nya konceptet är att parallellt utsätta enzymvarianterna i bakterier för ett tiotal olika kliniskt relevanta antibiotika. Arbetshypotesen är att det bildas en eller flera typer av nya muterade enzymer, som ger bakterierna överlevnadsvärde i närvaro av alternativa antibiotika. De identifierade enzymerna kommer att renframställas för strukturell och funktionell karakterisering på molekylär nivå. Vi kan på så vis finna betingelser för uppkomst av korsresistens mot olika läkemedel orsakad av mutationer i ett enzym. Resultaten från vårt modellsystem kommer att ge kunskap om grundläggande principer för uppkomst av enzymbaserad resistens mot alternativa läkemedel. Preliminära resultat visar att beta-laktamantibiotika kan gruppera resistensenzymerna i olika klusters med skilda funktionella egenskaper. Resistens uppstår samtidigt mot vissa antibiotika men inte mot alla testade. Denna kunskap är värdefull för design av nya läkemedel som inte ger upphov till korsresistens. Resultaten kan vidare generaliseras för utveckling av individbaserad behandling, baserad på val av läkemedel efter analys av målenzymet i den aktuella patienten. Sekvensanalys av ett enzym i kliniska prover är numera praktiskt och ekonomiskt möjlig.
 

2. Glutationtransferasers funktionella genomik

 
Glutationtransferaser (GST) är ursprungligen kända som avgiftningsenzymer i aeroba organismer. Tillgängliga forskningsresultat visat dock att enzymerna också kan ha andra roller i en cell. En fördjupad och integrerad förståelse av GST-proteinernas funktioner kräver en kombination av genetiska och biokemiska studier. Bananflugan Drosophila melanogaster erbjuder en synnerligen värdefull modell där sambanden mellan genotyp och fenotyp kan kartläggas och vars resultat i många fall är relevanta för andra organismer inklusive människa. Bananflugans 36 GST-gener kommer att framställas, motsvarande proteiner kommer att isoleras och deras betydelse för att motverka toxiska effekter kommer att undersökas. 
 
Toxiska ämnen som produceras av växter i försvaret mot insekter kommer att prövas som GST-substrat. Andra möjliga substrat är sådana skadliga ämnen som bildas när cellen utsätts för oxidativa skador. Vidare kommer DDT och andra insektsbekämpningsmedel att prövas som substrat. Slutligen kommer bindningen av bioaktiva molekyler till GST-proteiner att undersökas. Särskilt intresse kommer att riktas mot proteinkinaser som bidrar till regleringen av programmerad celldöd. Larver och adulta flugor kommer att behandlas med toxiska ämnen i syfte att se vilka GST som produceras för att skydda organismen. Den genetiska basen för GST-beroende skydd mot toxiska ämnen kommer att studeras med hjälpa av inaktivering av gener och framställning av transgena flugor.

 

3. Glutationtransferasers multipla funktioner i prevention, cytostatikaresistens och behandling av cancer

 

GST-enzymers olika roller i skydd mot cancer och behandling av tumörsjukdomar

 
 Alla kroppens celler är beroende av enzymer för olika funktioner. GST är ett enzym som oskadliggör giftiga ämnen som kan orsaka cancer. Broccoli och andra korsblommiga vegetabilier innehåller ämnen som skyddar mot cancer och som också ökar mängden GST i kroppens celler. Det är därför troligt att skyddet till en del beror på ökad mängd GST. Enzymet kan också verka på läkemedel och ändra deras effekt. Förstadier till läkemedel, prodroger, kan göras aktiva med hjälp av GST i kroppen och därmed bli verksamma i behandling av cancer.
 
Projektet har två delar: Först skall vi undersöka hur GST och vissa ämnen i kosten som skyddar mot cancer växelverkar i celler. Sedan skall vi med genetisk ingenjörskonst förbättra GST, så att syntetiskt enzym kan användas för att effektivisera cancerbehandling med prodroger. Särskilt intresse kommer att riktas mot svårbehandlad bröstcancer. Sådana tumörer kan kännas igen av det syntetiska enzymet och prodrogen kommer därför i första hand riktas sin avsedda verkan mot cancerceller och ge mindre skador på kroppens normala vävnader.
 
Det är en allmän uppfattning att det skulle vara till största nytta för individer och samhälle om uppkomsten av cancer skulle kunna förhindras eller fördröjas. Det finns tecken på att kosten kan spela en stor roll för att åstadkomma detta. Projektet syftar dels till förståelse av de kemiska omvandlingar som bidrar till skydd mot cancer för att kunna leda till kostrekommendationer. För klinisk behandling syftar projektet vidare till framställning av kombinationer av GST-enzym och prodroger som kan effektivisera den medicinska behandlingen av tumörsjukdomar.
 

Utvalda publikationer

 
  1. H.-S. Park, S.-H., Nam, J. K. Lee, C. N. Yoon, B. Mannervik, S. J. Benkovic and H.-S. Kim (2006) Design and evolution of new catalytic activity with an existing protein scaffold, Science 311, 535-538.
  2. M. A. Norrgård, Y. Ivarsson, K. Tars and B. Mannervik (2006) Alternative mutations of a positively selected residue elicit gain or loss of functionalities in enzyme evolution, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 103, 4876-4881.
  3. L.O. Emrén, S. Kurtovic, A. Runarsdottir, A.-K. Larsson and B. Mannervik (2006) Functionally diverging molecular quasi-species evolve by crossing two enzymes, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 103, 10866-10870.
  4. A. Runarsdottir and B. Mannervik (2010) A novel quasi-species of glutathione transferase with high activity towards naturally occurring isothiocyanates evolves from promiscuous low-activity variants. J. Mol. Biol. 401, 451–464.
  5. W. Zhang, D. F.A.R. Dourado, P.A. Fernandes, M.J. Ramos and B. Mannervik (2012) Multidimensional epistasis and fitness landscapes in enzyme evolution. Biochem. J. 445, 39-46.
  6. D.F.A.R. Dourado, P.A. Fernandes, M.J. Ramos and B. Mannervik (2013) Mechanism of glutathione transferase  P1-1-catalyzed activation of the prodrug canfosfamide (TLK286, TELCYTA®). Biochemistry 52, 8069-8078.
  7. U.M. Hegazy, Y. Musdal and B. Mannervik (2013) Hidden allostery in human glutathione transferase P1-1 unveiled by unnatural amino acid substitutions and inhibition studies. J. Mol. Biol. 425, 1509-1514.
  8. A.M.A. Mazari, O. Dahlberg, B. Mannervik and M. Mannervik (2014) Overexpression of glutathione transferase E7 in Drosophila differentially impacts toxicity of organic isothiocyanates in males and females. PLoS ONE 9(10): e110103.
  9. W. Zhang, D.F.A.R. Dourado and B. Mannervik (2015) Evolution of the active site of human glutathione transferase A2-2 for enhanced activity with dietary isothiocyanates. Biochim. Biophys. Acta 1850, 742–749.
  10. S. Govindarajan, B. Mannervik et al. (2015) Mapping of amino acid substitutions conferring herbicide resistance in wheat glutathione transferase. ACS Synth. Biol. 4, 221–227.
 

Textbook

 
P. David Josephy and Bengt Mannervik (2006) "Molecular Toxicology", 2nd Edition, Oxford University Press, New York.